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14 de febrero de 2017
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La Cromatografía Líquida de Alta Resolución acoplada a UV-Tornillo y MS (HPLC-UV/Vis-MS) es una técnica de gran importancia, ya que permite separar, analizar, cuantificar y caracterizar mezclas de productos poco o nada volátiles.
La Espectrometría de Masas de Alta Resolución es una técnica muy utilizada para la determinación o confirmación de la composición de compuestos. Això és degut al fet que s'obté la m/z de l'ió amb un error <5 ppm i, per tant, permet restringir dràsticament les fórmules moleculars assignables. En muchos casos se puede asignar una composición elemental e isotópica en la molécula. Además, la espectrometría de masas-masas (MS/MS), es decir, el estudio de las roturas que sufre un ion cuando se le proporciona energía, aporta información estructural y de conectividad de la molécula.
Es necesario 1 mg de muestra sin disolver (preferentemente) en vial de vidrio nuevo, acompañado de la solicitud de muestra donde se muestre la fórmula molecular, la estructura y la referencia de la muestra. Si la muestra se entrega disuelta no puede contener material precipitado, en este caso habría que filtrarla. Por otra parte, haber que informar del disolvente, y si se trata de una mezcla haber que informar, si es posible, de los componentes de esta.
Con respecto a la inyección por medio de columna, la muestra tiene que ser totalmente soluble en la fase móvil y tiene que estar filtrada. Si es necesario el uso de fases móviles tamponadas estas las tendrá que proporcionar el usuario.
Haber que informar de la toxicidad, precauciones de almacenaje y una vez entregada el informe si no se viene a buscar la muestra al cabo de una semana, después de este plazo el restante de esta será destruida.
La espectrometría de masas se fundamenta en la ionización de la muestra (permite analizar tanto iones positivos como negativos) y en la separación posterior de los iones (ion molecular y fragmentos) en fase gaseosa en función de su relación demasiado/carga (m/z).
L’analitzador de temps de vol (TOF) permet assignar la massa dels ions registrats amb una gran precisió (error<5 ppm), fent ús de la dependència de la velocitat amb la relació massa/carrega.
Estos iones son detectados como corrientes iónicas, cuyas intensidades son proporcionales a sus abundancias respectivas.
La muestra disuelta se introduce en el puerto de inyección del cromatógrafo. La muestra pasa por la columna cromatográfica gracias al bombardeo de la fase móvil que es una mezcla de disolventes. La diferente interacción de los anàlits con la fase móvil y con el rellenado de la columna permite la separación de los componentes de la mezcla. Esta técnica permite trabajar a elevadas presiones y eso hace incrementar la velocidad lineal de los compuestos dentro de la columna y reduce la difusión, mejorando la velocidad y la resolución de la cromatografía. Se puede trabajar de manera isocràtica (siempre con la misma mezcla de disolventes) o se puede utilizar un gradiente. También se pueden utilizar tampones para mejorar la separación de los compuestos. Finalmente, los componentes separados pueden ser detectados, caracterizados y/o cuantificados mediante diferentes tipos de detectores, como por ejemplo el espectrómetro de masas.
Electroesprai (ESI): Es una de las ionizaciones más suaves. Los iones se generan mediante la aplicación de una diferencia de potencial en un espray formado con la disolución de la muestra y un gas inerte (N2). El disolvente que hay en las pequeñas gotas cargadas se va evaporando y las moléculas de anàlit se aproximan y se repelen, hasta que finalmente, cuando la repulsión de las cargas del mismo signo es mayor que la tensión superficial, las gotas explotan. Este proceso se repite hasta que el anàlit queda libre de disolvente. Cryoespray (Cryo): Permite la generación de los iones a baja temperatura (hasta -100 °C), evitando la descomposición de la muestra. El gas de nebulización y de secado se enfrían utilizando nitrógeno gas frío.
Atmospheric Pressure Chemical Ionization (APCI): Permite trabajar con flujos de trabajo más elevados y muestras con una elevada polaridad. Primeramente, el eluent proveniente del UHPLC es nebulitzat y vaporizado a otras temperaturas. Seguidamente, se pone en contacto con un gas ionizado que es el encargado de transferir la ionización a nuestra muestra.
Detector de masas Quadrupol Temps de Vuelo (QTOF): Permite detectar iones positivos o negativos. El rango de masas es de 50 a 20.000 o 40.000 m/z. Se cuenta con tres fuentes de iones, Electrospray (ESI), Atmospheric Pressure Chemical Ionization (APCI) (permite utilizar flujos más elevados (ya que trabaja a temperaturas más altas) y disolventes no polares; genera más fragmentación), Criosprai (permite trabajar a baja temperatura (hasta -100ºC) solo con inyección directa. Por otra parte, el analizador qTOF permite analizar MS2, es decir, el estudio de las roturas que sufre un ion cuando se le proporciona energía, lo que aporta información estructural y de conectividad de la molécula. Además de ser utilizado como detector para el HPLC, se pueden analizar muestras puras o se pueden seguir reacciones introduciendo la muestra de manera directa por infusión mediante una bomba de jeringa de infusión continúa.
Los iones cargados son separados por su relación demasiado/carga (m/z). Los iones con n cargas se detectan en demasiado/n en unidades de demasiado. Los picos isotópicos n cargados se encuentran a distancia 1/n en unidades de demasiado. Eso permite una identificación fácil del estado de carga mediante el espectro isotópico resuelto.
El analizador híbrido quadrupol/temps de vuelo de alta resolución permite obtener espectros MS/MS con alta resolución en los iones fragmento.
Por la espectrometría de masas el poder de resolución del quadrupol se apaga. En este caso, el quadrupol funciona como guía adicional. En cambio, por la espectrometría de masas-masas se utiliza como filtro de masas para aislar un cierto ion o un rango de masas definido. En la celda de colisión se produce la Disociación Inducida por Colisión (CID) del/s iones seleccionados. Los iones “padres” aislados se aceleran y chocan con un gas neutro de colisión (N2). De esta manera se generan los fragmentos o iones “hijos” obteniendo un espectro de MS/MS que da información sobre la estructura de la molécula.
En el analizador de tiempo de vuelo los iones son acelerados de manera ortogonal y pasan a través de una región libre de campos en la que son separados según su relación m/z. Esta separación es debida al hecho de que los iones con una energía cinética fijada, si tienen diferentes valores de m/z, son acelerados a diferentes velocidades. La determinación (m/z) tiene lugar por la medida precisa del tiempo de deriva después de la aceleración ortogonal de los iones hasta impactar en el detector.
Las aplicaciones de esta técnica son muchas, ya que permite separar, caracterizar y cuantificar sustancias poco o nada volátiles de diversa naturaleza y procedencia. La posibilidad de utilizar varios tipos de columnas cromatográficas junto con la opción de seleccionar diferentes detectores(algunos de ellos se pueden utilizar en serie), hacen que sea posible la extracción de un gran volumen de información permitiendo abordar un abanico muy amplio de necesidades analíticas.
Especialmente útil es el uso del detector de masas ya que permito caracterizar moléculas puras o caracterizar y cuantificar mezclas de productos cuando se acopla a HPLC. Además, el analizador quadrupol tiempo de vuelo permite hacer MS2, es decir, el estudio de las roturas que sufre un ion cuando se le proporciona energía, lo cual aporta información estructural y de conectividad de la molécula.
Además, la opción de acoplar el método deionización cryoespray permite la identificación de especies a baja temperatura (hasta -100 °C) y, por lo tanto, facilita la detección de moléculas termolábiles y deintermedios de reacción con tiempo de vida corto que en las condiciones normales de ionización por ESI (T>150 °C) no podrían ser detectados.
Es posible ionizar y caracterizar con gran precisión moléculas con estructura muy diversa y compleja. Exemple concret: A diferència dels espectròmetres de masses de baixa resolució (generalment l'error en la massa d'aquests aparells és de ±0,2 unitats) el QTOF obté una gran exactitud en la m/z que permet distingir entre molècules amb m/z molt similar (error<5 ppm, per una molècula de m/z=300 seria ±0,0015).
Ejemplo concreto: Caracterización de cajas supramoleculares con capacidad para encapsular ful·lerens. L'estructura caracterizada es de gran complejidad y ten una masa molecular superior a los 12000 g/mol. Además, la técnica nos permite monitorar la encapsulación de diferentes ful·lerens y evaluar la afinidad de la caja para cada uno de ellos. Más información: “Sponge-like molecular cage for purification of fullerenes”. Nat. Commun., 2014, 5, 5557.
La temperatura del gas de nebulización y de secado puede llegar a los -100 °C, mientras que normalmente se utilizan temperaturas de entre 150-250 °C, lo cual suele provocar la descomposición de este tipo de moléculas. Ejemplo práctico: La reacción de1 en acetona a -90 °C con oxígeno da lugar a la formación de una especia de Cu (III) con puente bis oxo. Al añadir 3 equivalentes de 2,6-difluorobenzoat de sodio se obtiene una especie lila que corresponde a la coordinación de este último a la especie de Cu (III). Estas especies son altamente reactivas y tienen tiempos de vida muy cortos incluso en -90 °C. Sin embargo, se han podido observar en nuestro laboratorio mediante el uso del cryospray. Más información: Selective Ortho-Hydroxylation–Defluorination of 2-Fluorophenolates with a Bis(μ-oxo)dicopper(III) Species. Angew. Chem. Int. Ed., 2014, 53(36), 9608–9612.
Los iones obtenidos al medir una muestra (incluso aquellos obtenidos en condiciones de cryospray a -90ºC) pueden ser aislados y se pueden hacer chocar de manera controlada con el fin de obtener información estructural de la molécula mediante elanálisis de los fragmentos obtenidos después de la colisión. Por ejemplo, en el caso mencionado anteriormente, después de aislar y aplicar cierta energía, el pico del complejo con fenolat lo pierde al chocar con las moléculas de N2 de la celda de colisión. Eso nos permite decir que este compuesto se encuentra en la molécula sin reaccionar y que, por lo tanto, estamos observando el ion de la coordinación y no de la reacción de esta molécula con el Cu (III).
La adquisición del micrOTOF-QII ha sido subvencionado por el Ministerio de Ciencia e Innovación a través del proyecto INNPLANTA INP-2011-0059-PCT-420000-ACT1 y cofinanciado por el Fondo Europeo de Desarrollo Regional (FEDER) y el proyecto europeo Starting Grant ERC-2011-StG-277801.
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