Tesi doctoral de Vero Gordo Hernández: "Estudi de la reacció de trans-splicing i caracterizació fisicoquímica de la inteïna partida Neq DNA polimerasa B de l’hipertermòfil N. equitans". Direcció: Dr. Marc Ribó Panosa. Departament de Biologia
L’splicing de proteïnes és un procés autocatalític composat per diferents etapes que implica l’eliminació d’una seqüència interna, anomenada inteïna, de la cadena polipeptídica precursora i la formació d’un enllaç peptídic entre les regions flanquejants, anomenades exteïnes N i C. Les inteïnes partides o trans-inteïnes són un tipus d’inteïnes que estan codificades en dos gens diferents juntament amb els gens de l’exteïna N i l’exteïna C.
El gen de la DNA polimerasa B de l’arqueobacteri hipertermòfil Nanoarchaeum equitans estàdividit en dos marcs oberts de lectura. Els gens que codifiquen per les regions o dominis Nterminal i C-terminal de la polimerasa (exteïnes N i C) estan fusionats, respectivament, als gens que codifiquen per la inteïna N i la inteïna C de la inteïna partida Neq pol.
En la present tesi s’estudia la reacció de trans-splicing catalitzada per la inteïna partida Neq pol, així com es caracteritzen les propietats fisicoquímiques del fragment N-terminal, NeqN, i del complex NeqN/NeqC. D’altra banda, també s’estudia des d’un punt de vista cinètic i termodinàmic el procés d’associació entre els dos fragments de la inteïna.
La reacció de trans-splicing catalitzada in vitro per la inteïna Neq pol nomes es produeix a temperatures superiors als 50°C, amb una temperatura òptima de 80°C. Aquest fet indica que la temperatura regula la reacció de trans-splicing i que aquesta regulació pot produir-se per la pròpia inteïna o bé per les exteïnes. Amb l’objectiu d’esbrinar si la Neq pol és una inteïna depenent de temperatura, s’ha estudiat la reacció de trans-splicing en un context no natiu utilitzant diferents proteïnes com a exteïnes. Els resultats obtinguts suggereixen per una banda que la inteïna Neq pol no tolera els canvis d’exteïna, ja que només s’obté el producte de transsplicing quan s’utilitza la GB1 i ZHER2 com a exteïnes N i C, respectivament, i sempre que es conservin els set aminoàcids salvatges de la exteïna N en la regió adjacent a la Ser1 de la inteïna N i els 3 residus natius de l’extrem N-terminal de l’exteïna C. Aquest fet indica que els residus que es troben en les regions flanquejants del lloc d’unió inteïna-exteïna juguen un paper clau en la catàlisi de la reacció, segurament, orientant correctament els residus catalítics del centre actiu de la inteïna. I per altra banda els resultats obtinguts indiquen que la regulació de la reacció per la temperatura ve donada per la inteïna, ja que en aquest context no natiu el producte de la reacció de trans-splicing només s’observa a temperatures superiors als 50°C. La Neq pol és l’única inteïna partida descrita fins ara que conté com a residus catalítics una Ser en posició 1 i una Thr en posició +1, convertint-se en una excel·lent candidata per ser utilitzada en el marcatge isotòpic de proteïnes. Per a entendre millor el paper que juga en la reacció de trans-splicing la 2 Ser en posició 1, es va mutar per una Cys. Les dades experimentals obtingudes indiquen que la mutació Ser1Cys augmenta l’eficiència de la reacció. Paral·lelament, s’ha caracteritzat des d’un punt de vista fisicoquímic i estructural la inteïna N lliure, la qual presenta propietats característiques de les proteïnes hipertermofíliques, com ara Tm elevada, resistència a la desnaturalització per agents caotròpics, augment del grau d’empaquetament del nucli hidrofòbic i interaccions aromàtiques, el que ha permès obtenir-la primera estructura tridimensional del fragment N-terminal d’una inteïna partida. D’altra banda i gràcies al fet que la Neq pol és una inteïna depenent de temperatura s’ha pogut obtenir mitjançant cristal·lografia i difracció de raigs X l’estructura tridimensional del complex NeqN/NeqC i dur a terme la seva caracterització fisicoquímica. En l’estructura s’han pogut resoldre per primer cop els residus catalítics salvatges de la inteïna i també els residus natius de les exteïnes N i C. Finalment, utilitzant tècniques espectroscòpiques de fluorescència s’ha caracteritzat des d’un punt de vista cinètic i termodinàmic el procés d’associació dels dos fragments de la inteïna partida Neq pol. Com era d’esperar tenint en compte el caràcter hipertermofílic de la inteïna la velocitat d’associació augmenta gradualment amb la temperatura, obtenint el màxim de velocitat experimental a 64°C. Respecte a la termodinàmica del procés, els estudis experimentals mostren que es tracta d’un procés espontani (ΔG=-1.73 kcal/mol) amb un canvi entròpic entàlpic positiu, que indica que el mecanisme d’associació dels dos fragments de la inteïna Neq pol és diferent del proposat per altres inteïnes partides.