Tesi doctoral de Christian Curado Carballada: "Elucidating the role of conformational dynamics of Aspergillus Niger Monoamine oxidase towards enzymatic chiral amines chiral amines synthesis". Direcció: Dra. Sílvia Osuna Oliveras. i Dr. Ferran Freixa Gerones. Departament de Química
Al llarg del temps, els enzims han anat evolucionant fins a convertir-se en grans catalitzadors capaços d'accelerar reaccions químiques molts ordres de magnitud. Aquest poder catalític, juntament amb el fet que funcionen en condicions suaus, fan que els enzims siguin extremadament interessants per a la fabricació de productes rellevants industrialment. En aquest context, un dels reptes actuals de la indústria farmacèutica, és la producció d'amines enantiomèricament pures, difícilment assequibles per la catàlisi química tradicional. No obstant això, els enzims naturals amb prou feines són actius cap a substrats industrialment rellevants, i per aquest motiu, cal evolucionar-los per augmentar la seva activitat cap a nous substrats o reactivitats.
Els enzims són entitats dinàmiques, que poden explorar moltes conformacions que podrien ser rellevants per a la catàlisi. Mitjançant l'evolució al laboratori, les poblacions de les diferents conformacions es poden redistribuir, produint un desplaçament cap a conformacions catalíticament actives. Experimentalment, es poden utilitzar moltes tècniques amb aquest objectiu, destacant l'evolució dirigida (DE) recentment premiada amb el premi Nobel. No obstant això, les mutacions introduïdes mitjançant DE no són racionals, i requereixen molts recursos per a la seva validació experimental. Per superar aquesta limitació, es poden utilitzar mètodes computacionals per racionalitzar l'heterogeneïtat conformacional dels enzims, projectant totes les conformacions en l'anomenada Superfície d'Energia Lliure (FEL) mitjançant tècniques basades en la Dinàmica Molecular. A més, es poden utilitzar eines basades en correlació per dilucidar aquelles posicions que podrien alterar la FEL d'un enzim determinat i poden afavorir el canvi de població cap a la conformació activa. Un exemple d’eina de correlació es el Shortest Path Map (SPM), que utilitza teoria de grafs per determinar aquelles posicions de la proteïna que poden afectar més a la dinàmica conformacional.
En aquest context, aquesta tesi se centra en l'avaluació computacional de la dinàmica conformacional d'un conjunt de variants de monoamina oxidasa d'Aspergillus niger per a la producció biocatalítica d'amines quirals (salvatge, D3, D5 i D9). Amb aquest objectiu, s'han realitzat simulacions MD de l'homodímer juntament amb models d'estat de Markov, que van identificar tres conformacions principals d'una forquilla-β situada a ca. 20Å del centre actiu (és a dir, conformacions tancades, parcialment tancades i obertes). Vam observar que, al llarg del camí evolutiu, hi ha una clara tendència a estabilitzar conformacions tancades, així com a millorar els túnels del substrat que podrien conduir a una millor unió del substrat. A més, mitjançant SPM, vam detectar un camí de comunicació que connecta la forquilla-β d'un monòmer i el lloc actiu del contrari. Es va utilitzar la Dinàmica Molecular accelerada per avaluar l'efecte de les diferents conformacions forquilla-β sobre la unió del substrat a la subunitat oposada. Els nostres resultats suggereixen que per a l'enzim de tipus salvatge, es requereixen conformacions obertes per tenir una catàlisi eficient. Per contra, en les variants evolucionades, només es poden identificar com a actives conformacions tancades, mostrant que la comunicació entre monòmers s'ha vist interrompuda al llarg de l'evolució. El resultat de la tesi podria ajudar a desenvolupar noves variants enzimàtiques introduint mutacions a la forquilla-β, així com les posicions que afecten a la comunicació entre monòmers identificades en la nostra anàlisi SPM.