1. Introducció de Proteòmica
1.1. - concepte de proteòmica: diferents definicions i punts de vista.
- importància de la proteòmica. Repàs del flux genoma (epigenoma), transcriptoma, proteoma, modificacions postraduccionals (glicoma) fins al fenotip.
- proteòmica estructural vs proteòmica funcional.
- estratègies proteòmiques bottom-up vs top-down.
- exemples: Proteomic approach for biomarker discovery.
2. Adquirir els coneixements bàsics de preparació de mostres biològiques per a assajos proteòmics.
2.1. Sample preparation (the key to the success of the experiment)
• preparació de lisats: enzimàtica, sonicació, french press, morter, homogenització amb beads
• inactivació/eliminació de substancies interferents: proteases, àcids nucleics, polisacàrids, lípids, sals, material insoluble.
• quantificació de proteïna total: nanodrop, Bradford and BCA assays, etc
• solubilització: agents caotròpics (urea, tiourea), reductors (DTT, ßME) detergents (iònics, zwiteriònics) , carrier ampholytes, etc...
• prefraccionament: en base a diferent localització cel·lular, solubilitat, Mw, càrrega/pI, rang dinàmic (depleció de les proteïnes majoritàries en sèrum)
3. Entendre els fonaments bàsics de tècniques d’electroforesi bidimensional (2-DE), cromatografia líquida (LC) i espectrometria de masses (MS) des d’un punt de vista biomèdic.
3.1. Proteòmica diferencial (2DE two dimensional electroforesi):
• Primera dimensió: isoelèctric focusing (IEF). Amfolits vs immobilines/IGPstrips. Offgel fractionator. (ex: eritropoetina en el control antidopatge)
• Equilibrats: DTT, IAA
• Segona dimensió: SDS-PAGE
• Gel eluter: elució de la proteïna continguda en el gel de poliacrilamida.
• Staining: coomassie blue, silver staining, fluorescent dyes (sypro ruby, Cy3/5, deep purple, luminteine), radiactive labelling, PTMs specific staining, zymography etc...
• Western blot: blotting and double blotting, anticossos, solucions de bloqueig, marcatges enzimàtics (AP, HRP), detecció colorimètrica, quimioluminiscent, autoradiografia, fluorescència etc...
• Stripping (reprobing the same blot)
• Imatge analysis: Phoretix TM2D evolution software. Comparative proteomics (dif. expression levels) . 2DIGE typhoon imager.
• Protein databases: ex ExPASy swiss-2DPAGE viewer, ceruloplasmin from human plasma.
3.2. Identificació de proteïnes (importància de la espectrometria de masses).
- Què és la espectrometria de masses.
- Què necessita un espectròmetre de masses?: Ionization / mass separation / ion collection
- A century of developments in MS. (from first MS Thomson 1987 to ESI of biomolècules Fenn et al. 2002). Nobel prize 2002: Tanaka MALDI, Fenn ESI.
- Camps d’aplicació: biotecnologia, fàrmacs, clínica, ambiental, geològica, microbiològica etc.
- Informació que proporciona MS: MW macromolècules, heterogeneïtat, peptids (ex: eritropoetina). Polisacàrids (midó, N-glicans..). Molècules petites (àcids grassos).
- Com funciona un MS. 3 parts fonamentals (ion source, mass analyser, detector)
• Inlet: sample plate, target, HPLC, EC, GC, solid probe
• Ion source: MALDI, API, ESI, FAB, LSIMS, EI, CI
• Mass separation: TOF, Quadrupole, Ion Trap (orbitrap), magnètic sector, FTMS,
• Detector: microchannel plate, electron multiplier, hybrid...
• Data System: PC, SPARK station, DEC station
• High vacuum System (ionization, mass filter, detector) / turbo pumps.
- MALDI-TOF MS: matrix selection (CHCA, SA, Ferrulic àcid, DHB, HPA, etc...)
- pros and cons. Refector mode. Delayed extraction.
Calibració amb proteïnes estàndard. Interpretar espectres MALDI-TOF de proteïnes, pèptids i glicans.
- ESI-QQQ-MS: multi-charged ions
mass range/ polar compounds / good LOD / easy compatible MS/MS
4. Avaluar la importància de les tècniques proteòmiques en el descobriment de marcadors proteics i/o glicoproteics de malalties com per exemple les oncològiques. Potencial ús de les metodologies en el diagnòstic i seguiment d'aquestes malalties.
4.1. - Important concepts: mass resolution, accuracy, resolution, peak width at half height...
- Nominal mass, monoisotopic mass, most abundant mass, average mass
- Useful interpretation tools: isotopic resolution, fractional mass
- Mass spectra interpretation: MALDI TOF (mainly monocharged) vs ESI (multi-charged ions) explain deconvolution
- Real case bottom-up proteomics: proteins, 2DE, excise protein bands, destaining, in gel reduction, alkylation, protease digestion, identification MALDI peptide mass fingerprint.
- Spectra processing, calibration,
- Purging MS data (trypsin auto-proteolysis, keratin, artefactual peaks) peakErazor.exe software
- Peptide mass fingerprint: MASCOT (real examples)
- Uniprot, SwissProt databases for theoretical mass (in silico digestions)
5. Aprendre a interpretar espectres de masses i a utilitzar les bases de dades més emprades en el camp de la proteòmica.
5.1. - LC-ESI-QQQ
- Chromatogram OD vs ionogram TIC
- Modes of data acquisiton: SCAN and SIM. Product Ion Scan, Precursor Scan, Neutral Loss Scan, Multiple Reaction Mode. Exemples.
- QQQ pros and cons. LC-ESI-QQQ, LC-ESI-Q-TOF (Q-star polsar) , MALDI-TOF-TOF, QIT
- Mass spectra interpretation: aa masses, isobaric aa, peptide fragmentation, fragment ion nomenclature (a,b,c Nter vs x,y,z Cter).
- Tandem MS: de novo sequencing (spectra interpretation)
- Quantitation experimental paradigm (labelling):
SILAC- metabolic labelling,
ICAT - isotope coded affinity tag,
iTRAQ - isobaric tags
AQUA – absolute quantification (calibration-response curve)