Serveis Tècnics de Recerca

Cromatografia Líquida acoblada a Espectrometria de Masses (HPLC-MS)

La Cromatografia Líquida d’Alta Resolució acoblada a UV-Vis i MS (HPLC-UV/Vis-MS) és una tècnica de gran importància ja que permet separar, analitzar, quantificar i caracteritzar mescles de productes poc o gens volàtils

Sol·licitud de treball

Característiques de la mostra:

Injecció directe a l'espectròmetre de masses: Es necessari 1 mg de mostra sense dissoldre (preferentment) en vial de vidre nou, acompanyat de la sol·licitud de mostra on s’hi mostri la formula molecular, l’estructura i la referencia de la mostra. Si la mostra s'entrega dissolta no pot contenir material precipitat, en aquest cas caldria filtrar-la. Per altra banda, cal informar del dissolvent, i si es tracta d'un barreja cal informar, si és possible, dels components d'aquesta.

Pel que fa a la injecció per mitjà de columna, la mostra ha de ser totalment soluble en la fase mòbil i ha d'estar filtrada. Si és necessari l'ús de fases mòbils tamponades aquestes les haurà de proporcionar l'usuari. 

Cal informar de la toxicitat, precaucions d’emmagatzematge i un cop entregat l’informe si no es ve a buscar la mostra al cap d’una setmana, després d’aquest termini el restant d’aquesta serà destruïda.  

Imprès de sol·licitud de treball:

  Versió en Català
English version
MS Injecció Directa
           
           
HPLC/UV-Vis/MS
           

           

Característiques dels equips

Agilent Technologies LC 1200 series (HPLC) acoblat a Bruker Esquire 6000 Ion Trap (MS)

Any :
2008
Detector UV-Vis:
Detector de longitud d'ona variable G1314B
Detector de masses:
Trampa iònica Bruker Esquire 6000 Ion Trap
Fonts d’ionització: 
ESI i APCI
Precisió en Masses:
± 0.2 u
Modes d’operació:
Rang de Masses (m/z)  Resolució FWHM (u)  Velocitat de scan (u/s) 
  Normal 0.6 13000
Standard 50-3000  Alta 0.45 5500
  Màxima 0.3 1659
Extesa 200-6000 Normal 5 27000


Agilent Technologies LC 1200 series (HPLC) acoblat a Agilent Technologies 6120 Quadrupole (MS)

Any :
2010
Detector UV-Vis:
Detector de diodes en línia (DAD) G1315D
Columnes :
  • Eclipse XDB-C18. 150 x 4.6 mm, 5 μm Agilent Technologies
  • Chiralpak IC. 250 x 4.6 mm, 5 μm Daicel Corporation (Quiral)
  • Chiralpak IA. 250 x 4.6 mm, 5 μm Daicel Corporation (Quiral)

Ambdós HPLC compten amb

Com funciona?

La mostra dissolta en la fase mòbil s'introdueix al port d'injecció del cromatògraf. La mostra passa per la columna cromatogràfica gràcies al bombeig de la fase mòbil que és una mescla de dissolvents. La diferent interacció dels anàlits amb la fase mòbil i amb el farciment de la columna permet la separació dels components de la mescla. Aquesta tècnica permet treballar a elevades pressions i això fa incrementar la velocitat lineal dels compostos dins la columna i en redueix la difusió, millorant la velocitat i la resolució de la cromatografia. Es pot treballar de manera isocràtica (sempre amb la mateixa barreja de dissolvents) o es pot fer servir un gradient. També es poden utilitzar tampons per tal de millorar la separació dels compostos. Finalment, els components separats poden ser detectats, i/o caracteritzats i/o quantificats mitjançant diferents tipus de detectors.

Introducció de la mostra

L’UEM disposa d’injector automàtic amb capacitat de fins a 100 vials (vials de 1.8 mL). Cal dissoldre les mostres en dissolvents de puresa HPLC o superior i microfiltrar-les abans de ser mostrejades. Quantitat de mostra injectada entre 0,1 i 100 μL.

Separació cromatogràfica

El compartiment de la columna compta amb un termòstat que pot mantenir constant la temperatura: de 10 graus per sota de la temperatura ambient fins a 80°C (columnes de fins a 30 cm). 

Detectors

Ambdós equips compten amb detectors de masses i d’UV-Vis.

  • L’HPLC-VWD-ion trap compta amb els següents detectors:
    • Detector de longitud d’ona variable (VWD) per anàlisis d’una λ: Registra en continu la longitud d’ona programada de l’eluent de la columna. La font de radiació prové d’una làmpada de descàrrega d’arc de deuteri (rang de longituds d’ona: 190-600nm). A la sortida d'aquest detector es pot connectar en sèrie a un espectròmetre de masses per a extreure informació complementària.
    • Detector de masses amb analitzador Trampa Iònica (Bruker Esquire 6000): Permet detecta ions positius i/o negatius procedents de l’eluent de la columna. El rang de masses és de 50 a 3000 m/z i la precisió ±0.2 m/z. L’espectròmetre de masses treballa ionitzant la molècula mitjançant una font d’ions, i seleccionant i identificant els ions d’acord amb la relació massa/càrrega (m/z).
      Aquest equip compta amb dues fonts d’ions, Electrospray (ESI) Source (més suau) i Atmospheric Pressure Chemical Ionization (APCI) Source (permet fer servir fluxos més elevats (ja que treballa a temperatures més altes) i dissolvents no polars; genera més fragmentació).
      Per altra banda, l’analitzador trampa iònica permet analitzar MSn, és a dir, l'estudi dels trencaments que pateix un ió quan se li proporciona energia,el que aporta informació estructural i de connectivitat de la molècula.
      A més a més de ser utilitzat com a detector per a l’HPLC, es poden analitzar mostres pures o es poden seguir reaccions introduint la mostra de manera directe per infusió mitjançant una bomba de xeringa d'infusió continua.
  • L’HPLC-DAD-Single Quadcompta amb els següents detectors:
    • Detector de Diodes en Línia (DAD) per anàlisis multi- λ i espectrals: Registra en continu l’espectre UV-Vis de l’eluent de la columna. La font de radiació prové de la combinació d’una làmpada de descàrrega d’arc de deuteri pel rang de longituds d’ona a l’ultraviolat (UV, 190-800nm) i una làmpada de wolframi pel rang visible i l’infraroig proper (VIS-SWNIR 470-950).  En cas necessari, la sortida d'aquest detector es pot connectar en sèrie a un espectròmetre de masses per a extreure informació complementària.
    • Detector de masses amb analitzador Quadrupol Simple (Agilent Technologies 6120 Quadrupole LC/MS): Permet detecta ions positius i/o negatius procedents de l’eluent de la columna. El rang de masses és de 10 a 1500 m/z i la pressició ±0.2 m/z. La ionització de la mostra es du a terme a la font d’electrosprai (ESI), posteriorment els ions (ió molecular i fragments) en fase gasosa són separats en funció de la seva relació massa/càrrega (m/z). Aquests ions són detectats com a corrents iòniques, les intensitats dels quals són proporcionals a les seves abundàncies respectives.

Casos pràctics

Les aplicacions d’aquesta tècnica són moltes, ja que permet separarcaracteritzar i quantificar substàncies poc o gens volàtils de diversa natura i procedència.  La possibilitat d'utilitzar diversos tipus de columnes cromatogràfiques juntament amb  l'opció de seleccionar diferents detectors(alguns d'ells es poden utilitzar en sèrie), fan que sigui possible l'extracció d'un gran volum d'informació tot permetent abordar un ventall molt  ampli de necessitats analítiques.

Especialment útil és l'ús del detector de masses ja que permet caracteritzar molècules pures o caracteritzar i quantificar barreges de productes quan s'acobla a HPLC. A més a més, l’analitzador trampa iònica permet analitzar simultàniament el mode positiu i el negatiu, això és, fer l'estudi de molècules que al ionitzar formen ions positius o negatius alhora. Per altra banda, també permet fer MSn, és a dir, l'estudi dels trencaments que pateix un ió quan se li proporciona energia, la qual cosa aporta informació estructural i de connectivitat de la molècula.

 

Casos pràctics

Determinació de la puresa enantiomèrica. Exemple concret: Determinació de la separació enantiomèrica aconseguida mitjançant la utilització de MOFs especialment dissenyats per a enriquir enantiomèricament productes racèmics. Més informació: "Engineering Homochiral Metal–Organic Frameworks by Spatially Separating 1D Chiral Metal–Peptide Ladders:Tuning the Pore Size for Enantioselective Adsorption", Chem. Eur. J. 2015, 21, 9964–9969.  

 

Quantificació de productes i estudis mecanístics mitjançant marcatge isotòpic. En aquest cas, a més de quantificar els productes obtinguts en una reacció, s'ha utilitzat l'HPLC-MS per a estudiar la composició isotòpica dels productes obtinguts. D'aquesta manera, en el cas d'haver utilitzat reactius marcats isotòpicament, podrem saber si aquests han acabat formant part del producte de la reacció i en quina mesura. Els productes marcats isotòpicament són aquells que contenen àtoms amb una distribució isotòpica diferent a la que es troba a la natura. Per exemple, ho són els productes que contenen 18O, ja que l'isòtop més abundant de l'oxigen és l'16O. Per tant, la presència d'18O amb abundàncies superiors al 0.2% implica la participació en la reacció dels productes marcats isotòpicament introduïts. Els estudis de marcatge isotòpic són una font molt important d'informació mecanísitica. Més informació: Angew. Chem. Int. Ed.2014, 53(36), 9608–9612.

 

Caracterització de molècules orgàniques i complexos amb metalls de transició amb ESI-MS. L'espectròmetre de masses es pot utilitzar en solitari per tal de caracteritzar tant molècules orgàniques com complexos de metalls de transició. Exemple concret: Caracterització de la molècula [LFeO(CF3SO3)]+  mitjançant ESI-MS (m/z= 546.1) i confirmació de la presència del grup Fe=O mitjançant  el seguiment de l'intercanvi del grup oxo amb H218O. Més informació a: "Triggering the Generation of an Iron(IV)-Oxo Compound and Its Reactivity toward Sulfides by RuII Photocatalysis". J. Am. Chem. Soc., 2014, 136, 4624-4633.