Laboratori de DNA

Preparació de les mostres de DNA per seqüenciar, anàlisi de fragments i PCR quantitativa a temps real.

El laboratori de preparativa disposa de la instrumentació necessària per realitzar l’extracció d’àcids nucleics, quantificació per espectrefotometria, amplificació per PCR, electroforesi en gel d’agarosa. Condicions de treball en cabina de flux laminar amb làmpara UV, centrífuga refrigerada amb rotors per a tubs 1.5 mL. i plaques de 96 pous. A més de tot l'equipament bàsic per a un laboratori de biologia molecular.

 

Instrumentació

PE ABI PRISM 310 Genetic Analyzer de Applied Biosystems
Seqüenciador automàtic de fluorescència
Aparell d'electroforesi (d'un) capil·lar amb emissió làser i detecció de fluorescència
Determinació de seqüències de DNA i anàlisi de fragments de DNA


PE ABI PRISM 7700 Sequence Detector de Applied Biosystems
PCR quantitativa a temps real
Aparell termociclador de 96 pous amb emisió làser i detecció de fluorescència
Quantificació de DNA absoluta i relativa, anàlisi d'expressió gènica i determinació de GMO, SNP.


PE GENEAMP 9700 PCR SYSTEM de Applied Biosystems
Aparell termociclador de 96 pous per a amplificació de fragments de DNA per tècnica de PCR

Seqüenciació de DNA

La seqüenciació automàtica de DNA utilitza la metodologia de Sanger amb una polimerasa termoestable que permet una reacció de seqüenciació cíclica. El marcatge de les molècules generades es realitza amb 4 fluorocroms, un per a cada base (ddNTPs o terminadors). El producte de la reacció se separa per electroforesi en un capil·lar amb un polimer amb condicions desnaturalitzants. Un detector recull la fluorescència emesa pels fluorocroms per l’emissió del làser, i un software apropiat converteix el senyal de fluorescència en forma d’electroferograma. D’aquesta manera obtenim la seqüència de nucleòtids d’una mostra de DNA, el qual pot provenir d'una clonació en un vector o d'amplificat per PCR.

Anàlisi de fragments

El seqüenciador automàtic permet l’anàlisi de mida i quantitat de fragments de DNA amplificats per PCR i marcats per fluorescència. Aquesta metodologia utilitza encebadors marcats, amb els mateixos fluorocroms que es fan servir per a la seqüenciació de DNA, un d’ells s’utilitza com a estàndard intern que ens dóna la mida dels fragments. Aquest sistema ens ofereix una anàlisi senzilla i precisa de PCRs múltiples, ja que es poden combinar, en una mateixa mostra, mides i fluorocroms diferents per ser separats. Així obtenim patrons de bandes o “fingerprints” que podem utilitzar per identificar mostres especifiques de DNA com les tècniques de identificació humana i paternitats.

PCR quantitativa a temps real

Aquesta tècnica, com les anteriors, es base en l’emissió de fluorescència, però en aquest cas es troba en una sonda dissenyada per incorporar-se en la zona amplificada entre els dos encebadors (sondes TaqMan). Així en cada cicle de la PCR la fluorescència serà alliberada per l’acció de la polimerasa i després detectada, la qual ens donarà un valor del DNA amplificat. En la fase exponencial de la PCR, cada cicle del termociclador equival a una duplicació del DNA, d’aquesta manera podem conèixer la quantitat de DNA inicial. Marcant sondes amb diferents fluorocroms podem detectar diferents fragments amplificats i fer assajos de discriminació al.lèlica.

 

Espectrometria de masses MALDI-TOF

L’espectrometria de masses és una tècnica analítica d’alta capacitat per la seva sensibilitat i precisió en la determinació de masses moleculars i de la composició molecular de la qual es deriva.

Laboratori de preparació de mostres de pèptids i proteïnes per fer-les volar en el MALDI. Identificació de proteïnes per “fingerprint” en el qual es fragmenta la cadena polipeptídica per digestió enzimàtica de la proteïna separada en una electroforesi en gel de poliacrilamida.


Instrument:

Model ULTRAflex TOF de Bruker. Espectròmetre de masses a temps de vol (TOF) amb ionització per desorció làser assistida per matrius (MALDI).

















Analitzador lineal per a anàlisi de ions de càrrega positiva i negativa.

Làser de nitrogen. Reflector electrostàtic de ions. Anàlisi d’experiments PSD (Post-Source Decay). Paquet informàtic BioTools per a l’anàlisi i interpretació d’espectres.

Laboratori per a la preparació de mostres.


Funcionament:

Els espectròmetres de masses MALDI generen ions en fase gasosa mitjançant la vaporització induïda pel làser d’una mescla sòlida de mostra i matriu en la qual, aquesta última actua com a acceptor d’energia del làser que la transmet a la mostra, produint la sublimació dels ions de la matriu i la mostra. Els ions són accelerats en un camp elèctric per a després penetrar en un tub de vol lliure. Per a cert voltatge d’acceleració el temps de vol (TOF) del ió en arribar al detector és proporcional a la seva relació massa/càrrega (m/z). Les dues parts d’aquest instrument operen en condicions d’alt buit. Incrementant lleugerament la potència del làser es produeix una considerable fragmentació de l’analit, els ions evolucionen en la regió de recorregut lliure, aquest procés s’anomena PSD. Es millora la resolució màssica incorporant un reflector al final de la zona de vol que desvia la trajectòria dels ions fins a trobar un segon detector amb què s'aconsegueix informació estructural de la molècula original.


Aplicacions:

El MALDI-TOF treballa en l’anàlisi de molècules de pes molecular elevat per aconseguir la seva composició elemental. La tècnica MS/MS en ajuda en la caracterització estructural de compostos desconeguts i en l’anàlisi específic de mostres biològiques. Per les seves característiques, l’equip està dedicat a l’anàlisi de biomolècules (drogues, metabolits, oligosacàrids, oligonucleòtids, pèptids i proteïnes). Respecte a les proteïnes el MALDI-TOF pot proporcionar informació estructural a nivell de massa molecular, mapa de pèptids i estructura primària, seqüències i modificacions posteriors.

Personal tècnic

Vicenç Oliveras Llovera (llicenciat en Biologia) és el tècnic en biologia molecular que porta aquest servei, amb formació i preparació sobre les tècniques per treballar amb DNA, proteïnes, cultius cel.lulars i diferent software bioinformàtic. També té experiència en el treball de diferents línies de recerca : microbiologia, bioquímica, biologia cel.lular, genètica. Això permet donar suport a nous usuaris de les tècniques i equips de què disposem en el servei.